酸化劑主要包括單一酸化劑和復合酸化劑，單一酸化劑分為有機酸和無機酸。目前使用的無機酸化劑主要包括鹽酸、硫酸和磷酸，其中以磷酸居多。有機酸化劑主要有檸檬酸、延胡索酸、乳酸、丙酸、蘋果酸、山梨酸、甲酸、乙酸等。復合酸化劑是將2種或2種以上的單一酸化劑按照一定的比例復合而成，可以是幾種酸配合在一起使用，也可以是酸和鹽類復配而成，通過與飼料或水結(jié)合，動物食用后，能改善其消化道環(huán)境以滿足營養(yǎng)需要及疾病預防的需要[1]。下面將詳細說明飼料酸化劑中磷酸，檸檬酸，乳酸，富馬酸以及總酸含量的檢測方法。

1．磷酸的檢測

1.1磷酸的鑒別

磷酸是一種常見的無機酸，是中強酸，酸性強,在使用過程中極容易離解的特點；判斷飼料酸化劑中是否有磷酸可以用以下方法：

1.1.1試劑

氫氧化鈉溶液：4 0g/L  硝酸銀溶液，1 0 g/L 酚酞指示液：1 0 g/L

1.1.2 鑒別方法

稱取約1g試樣，置于100ml燒杯中，加10ml水，1滴酚酞指示液，用氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，滴加硝酸銀溶液，有黃色沉淀生成，該沉淀能溶于稀硝酸( 5 0 0 ) 或氨水。

1.2磷酸定量檢測方法—容量法

1.2.1 方法提要

根據(jù)磷酸性質(zhì)，以百里酚酞為指示液，用氫氧化鈉標準滴定溶液直接滴定，以確定磷酸含量。

1.2.2試劑

氫氧化鈉標準滴定溶液：約1mol/L；

百里酚酞指示液：1g/L

1.2.3 分析步驟

稱取約1.5克試樣，精確至0.0002克，移人250mL錐形瓶中， 加120mL水和5 滴百里酚酞指示液， 用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至淺藍色即為終點。

1.2.4 結(jié)果計算

磷酸( H3P O4) 含量的質(zhì)量分數(shù) W1 ， 數(shù)值以%表示， 按式( 2 ) 計算:

式中：

V — 滴定所消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值，單位為毫升 ( mL )；

c — 氫氧化鈉標準滴定溶液濃度的準確數(shù)值，單位為摩爾每升( mo l / L )；

m— 試樣的質(zhì)量的數(shù)值，單位為克；

M— 磷酸 (H3P O4) 的摩爾質(zhì)量的數(shù)值，單位為克每摩爾 ( g / m o l )  ( M = 4 9 ) .

取平行測定結(jié)果的算術平均值為測定結(jié)果; 平行測定結(jié)果的絕對差值不大于0.2%。

2．飼料酸化劑中總酸含量的測定：酸堿滴定法

2.1 方法摘要

根據(jù)酸堿中和原理，用堿液滴定試液中的酸，以酚酞為指示劑確定滴定終點。按照堿液的消耗量計算飼料中的總酸含量。

2.2 試劑與溶液：0.05mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液；1%酚酞溶液

2.3 分析步驟

精確稱取0.5克左右的飼料酸化劑樣品，置于250mL三角瓶中，加入50mL水及1%酚酞溶液2滴，氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至微紅色30S不褪色，記錄消耗0.05mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值（V1）。同一被測樣品應測定兩次。

空白試驗：用水代替試液，按照上面步驟操作，記錄消耗0.05mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值（V2）。

2.4 結(jié)果計算

飼料酸化劑中總酸含量以質(zhì)量分數(shù)X計，數(shù)值以克每千克（g/Kg）表示,按式(1)進行計算：

式中：

C— 氫氧化鈉標準滴定溶液濃度的準確數(shù)值，單位為摩爾每升（mol/L）；

V1—滴定試液時消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）;

V2—空白試驗時消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）;

K—酸的換算系數(shù)：蘋果酸：0.067；乙酸：0.06；檸檬酸：0.064；檸檬酸：0.07（含一分子結(jié)晶水）；乳酸：0.09；鹽酸：0.036；磷酸：0.049；

M—試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）.

計算結(jié)果表示到小數(shù)點后兩位。

2.5 允許差

同一樣品兩次測定結(jié)果之差，不得超過兩次平均測定值的2%。

3 乳酸，檸檬酸的同時測定

3.1儀器：Agilent 1200型高效液相色譜，帶紫外檢測器

3.2試劑：乳酸 檸檬酸標準品  磷酸二氫鉀-磷酸緩沖溶液（0.1N，PH約為3）蒸餾水

3.3 色譜條件

色譜柱：XDB--C18 4.6×150mm 5um；柱溫：30℃；進樣量：10ul;流速1ml/min;檢測波長：215nm;流動相：0.1mol/L磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)PH到3

3.4 樣品前處理：稱取適量樣品0.3—1.0克，加入100ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，0.45um濾膜過濾，上HPLC測定。

3.5乳酸、檸檬酸的測定

分別注射等體積20 μL的乳酸，檸檬酸標準溶液和樣品溶液進色譜，記錄色譜圖（乳酸，檸檬酸的保留時間大約是5min以內(nèi)）。記錄每張圖上乳酸，檸檬酸的峰面積響應。

3.6 乳酸、檸檬酸含量的結(jié)果計算

乳酸，檸檬酸含量按式（2）計算：

式中：

X2——乳酸或者檸檬酸的含量，單位為克每百克（%）；

AU——乳酸或者檸檬酸在樣品中的面積響應；

CS——乳酸或者檸檬酸標準樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；

AS——乳酸或者檸檬酸在標準品中的面積響應；

WU——乳酸或者檸檬酸樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）

3.7 方法定量檢出限

本標準的方法定量檢出限為：0.2mg/Kg

3.8 允許差

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

4.富馬酸的測定

富馬酸（Fumaric acid）又稱反丁烯二酸，紫堇酸、地衣酸，延胡索酸。通常為白色結(jié)晶粉末，有水果酸味。化學式是C4H4O4。為最簡單的不飽和二元羧酸。用于生產(chǎn)不飽和聚酯樹脂。

4.1原理

試樣經(jīng)緩沖液提取，固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜法檢測，根據(jù)保留時間和峰面積進行定性和定量。

4.2感官性狀：白色結(jié)晶顆?；蚍勰?，微溶于冷水，易溶于熱水。

4.3試劑和材料：磷酸：色譜純；蒸餾水；0.5%磷酸溶液:稱取0.495ml磷酸，加水至100ml溶解，經(jīng)0.45um濾膜過濾；蒸餾水：0.5%磷酸=9：1

4.4儀器和設備：高效液相色譜儀：配備紫外檢測器。

4.5色譜條件：色譜柱：色譜柱填充十八烷基硅膠，柱250×4.6 mm：流動相：蒸餾水：0.5%磷酸=9：1；流動相流速: 1 mL/min；檢測波長：205nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

注：系統(tǒng)適用性為三次重復注入標準溶液所得到的面積響應的相對標準誤差不大于2.0％。

4.6分析步驟

4.6.1 樣品溶液的制備

準確稱取50 mg的富馬酸樣品，置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻，取10ml置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻（含量>20%時）。

4.6.2 標準溶液的制備

準確稱取50mg富馬酸標準樣品，置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻，取10ml置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻。

注：因富馬酸微溶于冷水，易溶于熱水，蒸餾水應加熱。

4.6.3 富馬酸的測定

分別注射等體積20 μL的富馬酸標準溶液和樣品溶液進色譜，記錄色譜圖（富馬酸的保留時間大約是3min）。記錄每張圖上富馬酸的峰面積響應。

4.7 富馬酸含量的結(jié)果計算

富馬酸含量按式（2）計算：

式中：

X2——富馬酸的含量，單位為克每百克（%）；

AU——富馬酸在樣品中的面積響應；

CS——富馬酸標準樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；

AS——富馬酸在標準品中的面積響應；

WU——富馬酸樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）。

4.8 方法定量檢出限

本標準的方法定量檢出限為：0.2mg/Kg

4.9 允許差

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

5．分析與討論

5.1 摸索檢測有機酸的實驗條件。實驗中發(fā)現(xiàn)采用C18柱分離有機酸時，乳酸和乙酸的保留時間基本上一致，無法分離，如下圖所示：

采用Grom-Sil 能較好的分離乙酸和乳酸[2]。馮向東等文章中[3]采用硫酸酮作為流動相，乳酸和乙酸的分離結(jié)果還是不理想，如下圖：

5.2 檸檬酸，乳酸和富馬酸可以同時測定，但是由于富馬酸微溶于冷水，易溶于熱水的特性，樣品前處理方法不一致，且有些飼料酸化劑含富馬酸較多，峰形太大；建議單獨檢測富馬酸，結(jié)果更準確可靠。

5.3除上面的檢測方法以外,還可以對酸化劑酸化特性進行體外評定:

（1）pH 值評定：將酸化劑配成1%水溶液，用磁力攪拌器攪拌均勻，用 pH 計測定其 pH 值，以 60 秒內(nèi) pH 計讀數(shù)不變記為溶液的 pH 值，每個酸化劑樣品測 3 個平行，取其平均值。

（2）緩釋能力評定：酸化劑產(chǎn)品緩沖能力定義：單位時間 pH 值變化量，pH/h。 稱取酸化劑樣品 1.0g，用 99.0g 去離子水配成 1%水溶液，將其置于 37℃水浴鍋中，保持恒溫。每隔 1 小時用 pH 計測其 pH 值一次，以 pH 計讀數(shù)在 60 秒內(nèi)不變記為溶液pH 值，按照仔豬吃一次日糧的時間間隔，一般食物在仔豬消化道內(nèi)停留約 6 小時左右，所以共測定 7 次溶液 pH 值，每個樣品測 3 個平行，取其平均值，做出變化曲線，從而反映酸化劑的緩釋情況。

（3）緩沖能力評定：稱取 1.0g 酸化劑樣品，用 99.0g 去離子水配成 1%水溶液，用磁力攪拌器攪拌均勻，加熱并保持在 37℃，將 pH 計電極探頭插入溶液中，然后向溶液中滴加 1mol/L 的 NaOH溶液，直到 1%酸化劑水溶液 pH 值改變一個單位，記錄 NaOH 溶液的消耗量，即為酸化劑 1%水溶液緩沖量。每個樣測 3 個平行，取平均值。

（4）對日糧系酸力的影響能力評定：首先測定日糧的基礎系酸力，測定方法：用燒杯稱取100g常規(guī)仔豬日糧風干樣，加入 200ml 去離子水，用磁力攪拌器攪拌均勻，呈漿狀液，接著用 1mol/L 的鹽酸溶液滴定至 pH 值為 4.0，記錄所消耗鹽酸的毫升數(shù)。然后用同上的方法測定加酸化劑后日糧的系酸力。

日糧系酸力改變量＝日糧基礎系酸力－加酸后日糧系酸力。